PCR技術在基層疾控中心實驗室的應用案例
四川華銳凈化 2019-03-31 13:30:39 閱讀
【摘要】目的 為了具備病毒核酸檢測能力，對流感病毒和手足口病毒進行鑒定和分型。方法 1申請資金建立PCR實驗室；2 RT-PCR技術和Real-time PCR技術在流感和手足口病毒檢測中的應用；結果 1 2009年寧夏吳忠市PCR實驗室建成投入使用；2流感樣常規監測、暴發疫情快速確診流感病毒類型，熒光定量PCR技術和雙重熒光定量PCR技術對手足口病樣核酸鑒定和分型。結論 吳忠市PCR實驗室的建立，RT-PCR技術和Real-time PCR技術在基層疾控中心實驗室的運用，吳忠市疾控中心實驗室首次具備核酸檢測能力，提高了基層實驗室的技術能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數據，為我市的疾病防控工作能力提供了技術支撐，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎。建立基層PCR實驗室不盡是基層實驗室能力建設的一個巨大飛躍，更是在現代疾病預防控制事業中起到了巨大的作用。
【關鍵詞】PCR實驗室 基層 建立 現狀 應用
PCR技術是一種快速DNA片段擴增技術，具有高靈敏性、高特異性、簡便、快速以及對標本質量要求較低的特點，已經成為一種對標本中的特定DNA片段進行研究和檢測鑒定的重要方法，被廣泛用于病毒學診斷，尤其是病毒性疾病的早期診斷[1]。Real-time PCR是新研制出的一種核酸定量技術，該技術是在RT-PCR基礎上加入熒光標記探針來實現其定量功能的，在PCR反應系統中引入了熒光標記探針具有高靈敏性、高特異性和高精確性的特點。PCR 技術在基層疾控中心的開展，提高了基層實驗室的技術能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數據，為我市的疾病防控工作能力提供了技術支撐，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎，在現代疾病預防控制事業中起到了巨大的作用。
1 方法
1.1 吳忠市疾控中心申請建立PCR實驗室。
吳忠市PCR實驗室的建立有其歷史必要性。2009甲型H1N1流感爆發引發的相關疾病死亡，給人類生命財產和社會經濟發展帶來災難性的打擊。在當年的5月，還沒有特效治療的藥物，尚無有效的預防疫苗，相關的疫苗研發正在進行之中[2]。甲型H1N1流感疫情的蔓延和流行趨勢，引起全球人民的高度恐慌。我國密切關注甲型H1N1流感的發生和傳播，各級疾控中心加強監測和檢測，及時應對疫情的發生。面對可能大規模爆發的流感疫情，我們的實驗室檢測工作已經無法解決對疫情病毒的確診工作，無法滿足這種空前危機的局勢,擴大流感檢測實驗室，應對疫情危機已經是迫在眉睫的問題。實驗室檢測是確診流感病例的重要依據，為進一步加強疫情監測，嚴防疫情擴散，需逐步將現有流感監測網絡實驗室擴大到所有地市級疾病預防控制中心，因此建立基層PCR實驗室是這種歷史時期的必然趨勢。
PCR實驗室是分子生物實驗室，因其技術參數條件高，造價昂貴，開展工作耗資巨大，因此很難在基層實驗室建立。2009年，在特定的歷史時期，寧夏吳忠市疾控中心積極向上級部門和地方政府匯報建立PCR實驗室的必要性，并申請項目資金，申請審批在吳忠市疾控中心建立PCR實驗室。
1.2 RT-PCR技術和Real-time PCR技術在基層疾控中心實驗室的運用。
寧夏吳忠市PCR實驗室按照標準配置了普通PCR擴增儀、定量Real-time實時熒光PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、倒置顯微鏡、A2型生物安全柜、B2型生物安全柜、超凈工作臺、低溫冷凍離心機、培養箱、高壓鍋、-70攝氏度低溫冷凍冰箱、純水儀等儀器設備30余件。
在PCR實驗室建設同時，吳忠市疾控中心先后派出2名專業技術人員到寧夏自治區疾控中心病毒實驗室進行了專項培訓，通過考核，獲得了上崗證書。
2009年11月22日，經過寧夏回族自治區疾控中心專家的現場流感樣盲樣的考核驗收，達標后以RT-PCR技術開展流感核酸檢測工作開始正式投入使用，標志著PCR技術首次在基層實驗室的開展。
2 結果
2.1 在國家和地方政府的大力支持下，在單位領導的努力和各位專家的指導下，吳忠市PCR實驗室于同年11月份建成。
寧夏吳忠市PCR實驗室嚴格按照生物安全Ⅱ級的要求在市疾控中心進行設計和建設。 PCR技術基本原理就是將感樣本的特異基因組核酸基因片段通過聚集、提取、擴增，分析其擴增產物來確定流感病毒的類型。完成一組PCR實驗，通常應經過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產物分析四個實驗過程[3]。
寧夏吳忠市疾控中心的PCR實驗室在環境結構上是組合形式的PCR實驗室，是指完成PCR四個實驗過程的實驗和用房是相鄰布置的，組成獨立實驗區域的形式。實驗室設有PCR內部專用走廊。實驗室間有試劑配制室、樣品處理室、核酸擴增室及核酸擴增產物分析室組成。各室在入口處設置有緩沖間，以減少室內外空氣交換。我中心的PCR實驗室是通過獨立的送排風系統，控制氣流方向和壓差，氣流由清潔區流向污染區 。
2.2 目前，吳忠市PCR實驗室運用RT-PCR技術和Real-time PCR技術承擔來自哨點醫院（吳忠市人民醫院）的發熱病人的流感樣樣本的常規檢測，同時還擔負著整個吳忠市轄區暴發集體發熱疫情的現場快速檢測及實驗室確診檢測工作，確診流感病毒類型及分型。運用Real-time PCR技術和雙重Real-time PCR技術對本手足口病樣核酸鑒定和分型。對流感樣和手足口病樣核酸檢測，吳忠市PCR實驗室檢測的陽性樣品，全部都及時送到寧夏回族自治區疾控中心病毒科實驗室復核，結果一致，沒有出現結果異常或者是不符合情況。國家流感中心在2009年10月和2010年10月，兩次組織對國家流感網絡絡實驗室分別進行為數10份的流感盲樣標本分型考核，盲樣考核樣品由國家流感中心統一提供。吳忠市疾控中心流感網絡實驗室的考核盲樣結果符合率均為100%，順利通過，這是對工作人員盡快掌握RT-PCR技術和Real-time PCR技術的肯定。吳忠市PCR實驗室自建成開展工作以來，無安全事故發生，沒有檢測結果錯誤情況，一切運轉正常。
3 結論：
3.1 吳忠市PCR實驗室運用RT-PCR技術和Real-time PCR技術檢測包括甲型H1N1流感在內的各種流感病毒核酸，及時確診流感病毒的類型及其亞型，為流感疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數據，為提高我市的疾病防控工作能力提供了技術支撐。
3.2 在吳忠市PCR實驗室運用熒光定量PCR技術和雙重熒光定量PCR技術檢測手足口病核酸分型，暴發疫情快速確診腸道病毒類型，掌握EV71和CoxA16感染流行特征，為疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數據，同時為臨床診斷以及制定預防措施提供依據。
3.3 吳忠市PCR實驗室，作為一個分子診斷實驗室，能夠為將來開展PCR技術支持的任何其它病毒核酸檢測提供實驗環境，在今后的發展中將會發揮其最大效應，也許在不久的將來，丙肝病毒、艾滋病毒、乙腦病毒、輪狀病毒、流感病毒、麻疹病毒、腺病毒、EB病毒、風疹病毒等需要PCR技術支持病毒核酸檢測都能夠在吳忠市疾控中心這樣的基層PCR實驗室完成。PCR技術在吳忠市疾控中心實驗室的運用，提高了實驗室的技術能力，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎。。
寧夏吳忠市PCR實驗室的建成啟用，極大地提高了我市流感傳染病和手足口病診斷的及時性和準確性，對有效預防控制流感病毒和手足口病傳染病發揮重要的指導性作用。RT-PCR技術和Real-time PCR技術在基層疾控中心實驗室的運用，吳忠市疾控中心實驗室首次具備核酸檢測能力，提高了基層實驗室的技術能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數據，為我市的疾病防控工作能力提供了技術支撐，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎。建立基層PCR實驗室不盡是基層實驗室能力建設的一個巨大飛躍，更是在現代疾病預防控制事業中起到了巨大的作用。
【關鍵詞】PCR實驗室 基層 建立 現狀 應用
PCR技術是一種快速DNA片段擴增技術，具有高靈敏性、高特異性、簡便、快速以及對標本質量要求較低的特點，已經成為一種對標本中的特定DNA片段進行研究和檢測鑒定的重要方法，被廣泛用于病毒學診斷，尤其是病毒性疾病的早期診斷[1]。Real-time PCR是新研制出的一種核酸定量技術，該技術是在RT-PCR基礎上加入熒光標記探針來實現其定量功能的，在PCR反應系統中引入了熒光標記探針具有高靈敏性、高特異性和高精確性的特點。PCR 技術在基層疾控中心的開展，提高了基層實驗室的技術能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數據，為我市的疾病防控工作能力提供了技術支撐，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎，在現代疾病預防控制事業中起到了巨大的作用。
1 方法
1.1 吳忠市疾控中心申請建立PCR實驗室。
吳忠市PCR實驗室的建立有其歷史必要性。2009甲型H1N1流感爆發引發的相關疾病死亡，給人類生命財產和社會經濟發展帶來災難性的打擊。在當年的5月，還沒有特效治療的藥物，尚無有效的預防疫苗，相關的疫苗研發正在進行之中[2]。甲型H1N1流感疫情的蔓延和流行趨勢，引起全球人民的高度恐慌。我國密切關注甲型H1N1流感的發生和傳播，各級疾控中心加強監測和檢測，及時應對疫情的發生。面對可能大規模爆發的流感疫情，我們的實驗室檢測工作已經無法解決對疫情病毒的確診工作，無法滿足這種空前危機的局勢,擴大流感檢測實驗室，應對疫情危機已經是迫在眉睫的問題。實驗室檢測是確診流感病例的重要依據，為進一步加強疫情監測，嚴防疫情擴散，需逐步將現有流感監測網絡實驗室擴大到所有地市級疾病預防控制中心，因此建立基層PCR實驗室是這種歷史時期的必然趨勢。
PCR實驗室是分子生物實驗室，因其技術參數條件高，造價昂貴，開展工作耗資巨大，因此很難在基層實驗室建立。2009年，在特定的歷史時期，寧夏吳忠市疾控中心積極向上級部門和地方政府匯報建立PCR實驗室的必要性，并申請項目資金，申請審批在吳忠市疾控中心建立PCR實驗室。
1.2 RT-PCR技術和Real-time PCR技術在基層疾控中心實驗室的運用。
寧夏吳忠市PCR實驗室按照標準配置了普通PCR擴增儀、定量Real-time實時熒光PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、倒置顯微鏡、A2型生物安全柜、B2型生物安全柜、超凈工作臺、低溫冷凍離心機、培養箱、高壓鍋、-70攝氏度低溫冷凍冰箱、純水儀等儀器設備30余件。
在PCR實驗室建設同時，吳忠市疾控中心先后派出2名專業技術人員到寧夏自治區疾控中心病毒實驗室進行了專項培訓，通過考核，獲得了上崗證書。
2009年11月22日，經過寧夏回族自治區疾控中心專家的現場流感樣盲樣的考核驗收，達標后以RT-PCR技術開展流感核酸檢測工作開始正式投入使用，標志著PCR技術首次在基層實驗室的開展。
2 結果
2.1 在國家和地方政府的大力支持下，在單位領導的努力和各位專家的指導下，吳忠市PCR實驗室于同年11月份建成。
寧夏吳忠市PCR實驗室嚴格按照生物安全Ⅱ級的要求在市疾控中心進行設計和建設。 PCR技術基本原理就是將感樣本的特異基因組核酸基因片段通過聚集、提取、擴增，分析其擴增產物來確定流感病毒的類型。完成一組PCR實驗，通常應經過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產物分析四個實驗過程[3]。
寧夏吳忠市疾控中心的PCR實驗室在環境結構上是組合形式的PCR實驗室，是指完成PCR四個實驗過程的實驗和用房是相鄰布置的，組成獨立實驗區域的形式。實驗室設有PCR內部專用走廊。實驗室間有試劑配制室、樣品處理室、核酸擴增室及核酸擴增產物分析室組成。各室在入口處設置有緩沖間，以減少室內外空氣交換。我中心的PCR實驗室是通過獨立的送排風系統，控制氣流方向和壓差，氣流由清潔區流向污染區 。
2.2 目前，吳忠市PCR實驗室運用RT-PCR技術和Real-time PCR技術承擔來自哨點醫院（吳忠市人民醫院）的發熱病人的流感樣樣本的常規檢測，同時還擔負著整個吳忠市轄區暴發集體發熱疫情的現場快速檢測及實驗室確診檢測工作，確診流感病毒類型及分型。運用Real-time PCR技術和雙重Real-time PCR技術對本手足口病樣核酸鑒定和分型。對流感樣和手足口病樣核酸檢測，吳忠市PCR實驗室檢測的陽性樣品，全部都及時送到寧夏回族自治區疾控中心病毒科實驗室復核，結果一致，沒有出現結果異常或者是不符合情況。國家流感中心在2009年10月和2010年10月，兩次組織對國家流感網絡絡實驗室分別進行為數10份的流感盲樣標本分型考核，盲樣考核樣品由國家流感中心統一提供。吳忠市疾控中心流感網絡實驗室的考核盲樣結果符合率均為100%，順利通過，這是對工作人員盡快掌握RT-PCR技術和Real-time PCR技術的肯定。吳忠市PCR實驗室自建成開展工作以來，無安全事故發生，沒有檢測結果錯誤情況，一切運轉正常。
3 結論：
3.1 吳忠市PCR實驗室運用RT-PCR技術和Real-time PCR技術檢測包括甲型H1N1流感在內的各種流感病毒核酸，及時確診流感病毒的類型及其亞型，為流感疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數據，為提高我市的疾病防控工作能力提供了技術支撐。
3.2 在吳忠市PCR實驗室運用熒光定量PCR技術和雙重熒光定量PCR技術檢測手足口病核酸分型，暴發疫情快速確診腸道病毒類型，掌握EV71和CoxA16感染流行特征，為疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數據，同時為臨床診斷以及制定預防措施提供依據。
3.3 吳忠市PCR實驗室，作為一個分子診斷實驗室，能夠為將來開展PCR技術支持的任何其它病毒核酸檢測提供實驗環境，在今后的發展中將會發揮其最大效應，也許在不久的將來，丙肝病毒、艾滋病毒、乙腦病毒、輪狀病毒、流感病毒、麻疹病毒、腺病毒、EB病毒、風疹病毒等需要PCR技術支持病毒核酸檢測都能夠在吳忠市疾控中心這樣的基層PCR實驗室完成。PCR技術在吳忠市疾控中心實驗室的運用，提高了實驗室的技術能力，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎。。
寧夏吳忠市PCR實驗室的建成啟用，極大地提高了我市流感傳染病和手足口病診斷的及時性和準確性，對有效預防控制流感病毒和手足口病傳染病發揮重要的指導性作用。RT-PCR技術和Real-time PCR技術在基層疾控中心實驗室的運用，吳忠市疾控中心實驗室首次具備核酸檢測能力，提高了基層實驗室的技術能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數據，為我市的疾病防控工作能力提供了技術支撐，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎。建立基層PCR實驗室不盡是基層實驗室能力建設的一個巨大飛躍，更是在現代疾病預防控制事業中起到了巨大的作用。
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